Блог

Jun 18, 2023

Простой метод создания, улавливания и деформации везикулы в геле.

Научные отчеты, том 13,

Научные отчеты, том 13, Номер статьи: 5375 (2023) Цитировать эту статью

1406 Доступов

5 Альтметрика

Подробности о метриках

Мы представляем простой метод получения гигантских липидных псевдовезикул (везикулы с маслянистой крышкой сверху), запертых в агарозном геле. Метод может быть реализован с использованием только обычной микропипетки и основан на формировании двойной капли вода/масло/вода в жидкой агарозе. Мы характеризуем полученную везикулу с помощью флуоресцентной визуализации и устанавливаем наличие и целостность липидного бислоя путем успешной вставки трансмембранных белков \(\alpha \)-гемолизина. Наконец, мы показываем, что везикулу можно легко механически деформировать, неинтрузивно, путем вдавливания поверхности геля.

Везикулы широко используются для имитации клеточной компартментализации и воспроизведения специфических биологических функций in vitro с использованием подходов «снизу вверх»1,2. Во многих недавних исследованиях основное внимание уделялось инкапсуляции сложных биологических реакций внутри везикул с целью экспрессии белков3 или генов4, а также для восстановления и изучения белковых нитей цитоскелета, таких как актиновая кора5 или астры микротрубочек6. Многие другие работы направлены на имитацию свойств клеточных мембран, таких как, например, слияние мембран7,8,9 или клеточная коммуникация, путем внедрения трансмембранных белков в липосомы. В частности, в мембрану липосом были встроены механочувствительные каналы10,11, что, в свою очередь, позволило измерить их проводимость при механическом воздействии.

Производство везикул обычно основано либо на методах гидратации, либо на матрицах инвертированной эмульсии. Методы гидратации основаны на набухании высушенных липидных пленок в водном буфере12,13. Они относительно просты в эксплуатации, но обеспечивают полидисперсные размеры везикул и относительно неоднородную эффективность инкапсуляции14,15,16. Скорость производства однослойных везикул можно повысить с помощью электрических полей (методы электроформирования17), но хрупкие белки могут быть повреждены приложенными полями18,19, и этот метод также ограничен буферами с низкими ионными концентрациями. С другой стороны, шаблоны обращенной эмульсии основаны на принудительном прохождении капель эмульсии вода в масле через границу раздела вода/масло5,20. Этот метод может быть разработан в микрофлюидных чипах21,22,23,24, что позволит получить размеры монодисперсных везикул, которые ограничены размерами микрофлюидных каналов.

В обоих методах (гидратация или эмульсии) полученные везикулы диспергируются во внешней среде, что требует дополнительных действий по обработке или переносу их в различные среды (микропипетки25, оптический захват26 и т.д.). Эти дополнительные шаги, требующие определенных технических навыков, затрудняют повторение многих экспериментов и сбор больших статистических данных о свойствах систем. В частности, для изучения процессов механотрансдукции требуется механическая стимуляция везикул. На практике этого обычно достигали за счет локальных деформаций мембраны (отсасывание пипеткой27, потоки жидкости28,29, AFM30,31). Однако эти методы не воспроизводят достоверно природу механических возмущений в тканях. Кроме того, они упускают из виду механическую связь между клетками и их биологической вязкоупругой средой.

Мы предлагаем здесь новую технику, которая обеспечивает универсальную платформу для прямого производства биомиметических псевдовезикул (везикулы с маслянистой крышкой сверху), а также позволяет их захватывать и неинтрузивное механическое возбуждение.

(а–е) (верхний ряд) Схема получения двойной эмульсии. Зеленый/оранжевый/синий цвета обозначают внутреннюю/масляную/внешнюю фазы соответственно. (нижний ряд) Изображения светлого поля. Масштабные линейки = 500 \(\mu \)м. Образовавшаяся капля двойной эмульсии в (f) оседает в жидкой агарозе и в конечном итоге улавливается в виде агарозных гелей. Одновременно окружающая масляная оболочка в верхней части капли кремируется, а в нижней части застегивается липидный бислой. Через несколько минут псевдовезикула сформировалась и зафиксировалась в геле, как показано на (g). Нижняя панель: флуоресцентное макроскопическое изображение псевдовезикулы, наполненной карбоксифлуоресцеином, заключенным в агарозный гель. Масштабная линейка = 200 \(\mu \)м.